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    免疫組織化染色

    發(fā)布時間: 2023-04-10  點擊次數(shù): 907次

    材料與儀器

    新鮮組織
    二甲苯 酒精 H2O2 抗原修復(fù)液 枸櫞酸鈉緩沖液 石蠟 福爾馬林 PBS DAB 蘇木素 樹膠 丙酮 打孔液 檸檬酸鈉 APES
    恒溫搖床 高壓鍋 塑料切片架 耐溫玻璃容器 -80℃冰箱 恒冷冰凍切片機 載玻片

    步驟

    一.石蠟切片免疫組化染色實驗步驟:
    1.石蠟切片脫蠟至水:(石蠟切片染色前應(yīng)置60℃ 1 小時)。
    (1)二甲苯I、II,各10 分鐘。
    (2)梯度酒精:100%,2 分鐘® 95%,2 分鐘® 80%,2 分鐘® 70%2 分鐘。
    (3)蒸餾水洗:5 分鐘,2 次(置于搖床)。
    2.過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶:3%H2O2,室溫10 分鐘(避光)。
    3.蒸餾水洗:5 分鐘,2 次(置于搖床)。
    4.抗原修復(fù):
    根據(jù)待檢測的抗原,選擇適當?shù)姆椒ā?/div>
    附:抗原修復(fù)液(10mM pH 6.0 枸櫞酸鈉緩沖液)的配制
    (1)儲備液的配制:
    A 液:枸櫞酸三鈉-2H2O 29.41g + 蒸餾水1000ml
    B 液:枸櫞酸21g + 蒸餾水1000ml
    (2)工作液的配制:A 液82ml + B 液18ml + 蒸餾水900ml
    抗原修復(fù)的方法:
    (1)高壓鍋處理技術(shù):枸櫞酸鈉緩沖液(10mM,PH6.0),淹沒切片,蓋上鍋蓋,高壓鍋內(nèi)煮沸,上汽3 分鐘后緩慢冷卻(可用自來水在高壓鍋外沖,以助冷卻)。
    (2)微波處理技術(shù):用塑料切片架,置于塑料或耐溫玻璃容器內(nèi),枸櫞酸鈉緩沖液淹沒切片,選擇中高或高檔,5 分鐘;取出并補充已預(yù)熱的枸櫞酸鈉緩沖液;再選擇中高或高檔,5 分鐘(. 最佳溫度為92~95℃)
    (3)酶消化處理:此略。
    抗原修復(fù)的注意事項:
    (1)組織不能干。
    (2)選擇抗原修復(fù)方法要因抗體而異。
    (3)該方法主要用于10%福爾馬林固定、石蠟包埋組織。
    (4)抗原修復(fù)后至DAB 顯色的過程中,均需用PBS 緩沖液。
    5.PBS:5 分鐘,2 次(置于搖床)。

    6.正常血清封閉:從染片缸中取出切片,擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分(保持組織呈濕潤狀態(tài)),滴加正常山羊或兔血清(與第二抗體同源動物血清)處理,37℃,15 分鐘。


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